色譜柱可分為填充柱和開(kāi)管柱兩大類(lèi)。多為金屬或玻璃制作。有直管形、盤(pán)管形、U形管等形狀。液相色譜通常均采用填充柱。色譜柱的分離效果取決于所選擇的固定相，以及色譜柱的制備和操作條件。  

1.網(wǎng)上對柱子是否可以反沖一直有爭論，那什么樣的柱子可以反沖，什么不可以。反沖后是正著(zhù)用，還是反著(zhù)用。具體到各型號柱子不僅是ODS柱，其他如，正向柱、氨基柱、離子交換柱等。  

答：一般的正相反相柱應該都能反沖，只有兩端篩板孔徑不對稱(chēng)的柱子不能反沖，不過(guò)目前這樣的柱子已經(jīng)比較少見(jiàn)了。反沖是為了把柱頭的污染物沖洗掉，反沖后還是正著(zhù)用比較好，以免柱子的兩頭都被污染，提倡：正向使用，反向沖洗。  

2.對于一根常用的C18柱，拿到一根新柱的時(shí)候應該怎樣進(jìn)行活化及維護？為什么要這樣做？  

答：新柱活化，實(shí)際上是一個(gè)平衡的過(guò)程，除了用流動(dòng)相平衡外，有時(shí)候還必須用所測樣品對新柱進(jìn)行平衡，特別是測定分子量比較高的多肽，尤其重要。因為，分子量高的物質(zhì)分子，擴散速度慢，平衡所需時(shí)間也相應較長(cháng)。具體平衡方式也很簡(jiǎn)單，多進(jìn)幾次樣品，直到峰面積和保留時(shí)間穩定，再進(jìn)行正式進(jìn)樣測定。  

如果要加快平衡時(shí)間，把前面用來(lái)平衡的進(jìn)樣樣品濃度加大，或者不等洗脫完成，連續進(jìn)樣多針。用待測物對新柱平衡，目的是：將硅膠基質(zhì)填料表面具有非特異性吸附的位點(diǎn)的吸附能力飽和掉。  

3.氨基柱在進(jìn)酸性樣品時(shí)，很傷柱子，如使用一段時(shí)間后，柱效降低，峰形改變，如何恢復？  

答：氨基柱測酸性樣品，應該是用氨基柱的HILIC模式。酸的存在可能會(huì )使略帶負電荷的氨基官能團質(zhì)子化，導致使用一段時(shí)間后對于某些類(lèi)的分析物保留性質(zhì)有所改變或表現在柱效下降。建議：用5～10倍的柱體積的含0.5～1.0％NH3的乙腈-水(50：50)溶液沖洗該柱（沖洗后當然要再用不含堿的流動(dòng)相洗去多余氨），之后，再進(jìn)行分析這類(lèi)酸性分析物時(shí)建議在流動(dòng)相中略微添加少許氨如，0.1％。  

4.柱子在什么情況下可以清洗一下篩板呢？原來(lái)也討論過(guò)這個(gè)問(wèn)題，有人也拆下來(lái)清洗過(guò)，但看到柱前段的污染更甚，于是就用刀片刮了刮，然后把清洗好的篩板安裝上去。問(wèn)題解決了，但使用壽命會(huì )不會(huì )減少呢？  

答：柱頭污染了，就取出污染的，再裝一些填料。因為，假如你刮了些填料，那么微觀(guān)的塔板數就少了。假如你刮得不多，僅表面，可能就是一些臟物，所以，問(wèn)題解決，但是，今后還會(huì )有同樣問(wèn)題，影響柱效。建議還是裝一個(gè)預柱。  

5.如果柱子取下來(lái)放置一段時(shí)間，需要做什么保護嗎？  

答：對一般的反相柱，洗干凈后放到純甲醇（乙腈）或者是80%左右的甲醇（乙腈）水中，然后用堵頭塞緊柱兩頭，以免保存溶劑揮發(fā)，應該不需要做特殊的保護。  

6.流動(dòng)相中加入適量的四氫呋喃可以改善峰形的機理是什么？  

答：甲醇為質(zhì)子給予體、乙腈為質(zhì)子接受體、四氫呋喃是偶極溶劑，應該除了極性影響，還有另外的影響因素，至于分離機理，還是比較復雜的，不能看成是個(gè)萬(wàn)能方法。  

7.預柱或保護柱用還是不用的問(wèn)題？  

答：應該這樣說(shuō)，加上保護柱，肯定有利于保護色譜柱不受一些顆粒物質(zhì)的堵塞，肯定有害于分離度和柱效，因為保護柱中間有著(zhù)死體積的存在但是如果保護柱接得好并且盡量控制其匹配性和經(jīng)常更換，分離度和柱效應該影響并不大。頭孢類(lèi)的抗生素也要看到底是原料藥還是制劑嘍，有些原料藥，可以根據色譜柱的損耗選擇添加預柱（中間是個(gè)篩板），制劑的話(huà)，如果有輔料嚴重干擾或者流動(dòng)相鹽分比較大，那還是***好配個(gè)保護柱。  

8.想請您具體說(shuō)明一下反沖色譜柱的方法，是不連檢測器嗎？  

答：反沖就是將柱子反向連到系統中。因為，有污染物反沖出來(lái)，當然不連檢測器，出液端直接接到廢液瓶就可以。  

9.waters，AtlantisC18柱可以用較高比例的流動(dòng)相，那么用完后應該怎么清洗？在什么體系中保存比較合適？  

答：反相柱都可以用下面通用的方法清洗維護：  

流動(dòng)相中不含緩沖鹽：分析完成后，用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向沖洗色譜柱45min  

流動(dòng)相中含有緩沖鹽：分析完成后，先用甲醇（或乙腈）：水＝10：90反向沖洗45min，然后再用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向沖洗色譜柱45min；（注意：甲醇（或乙腈）：水＝10：90容易長(cháng)菌，使用時(shí)間不可超過(guò)3天）；  

水性柱保存體系也不特別：  

短期保存在所用的流動(dòng)相中（不含緩沖鹽），中長(cháng)期保存在純甲醇（乙腈）或80%的甲醇（乙腈）/水中。  

10.正相硅膠柱一般保存在什么溶劑里面比較合適？  

答：短期和長(cháng)期都建議保存在正相測定所用的流動(dòng)相中，一般是正己烷和極少量的異丙醇。  

11.多個(gè)樣品不好分離的時(shí)候，請問(wèn)該怎么通過(guò)選擇合適的柱子來(lái)提高分離度？  

答：提高分離度可從三個(gè)主要影響因素來(lái)考慮，柱效、選擇性和保留因子?？赏ㄟ^(guò)減小填料粒徑和增加柱長(cháng)提高柱效；選擇性和固定相選擇以及pH條件有關(guān)，通過(guò)選擇合適的色譜柱和合適的pH，可以提高選擇性；有時(shí)候適當延長(cháng)出峰時(shí)間增加保留因子，也可提高分離度。  

12.我們測試樣品時(shí)，經(jīng)常會(huì )關(guān)心柱壓是否太高，但是在購買(mǎi)色譜柱時(shí)，并沒(méi)有說(shuō)每一根色譜柱的***大使用壓力是多少？針對這樣的情況，用戶(hù)怎么判斷柱壓是否超過(guò)該柱的極限？  

答：裝柱時(shí)的壓力比使用時(shí)高很多，所以柱壓對色譜柱本身在使用時(shí)沒(méi)有極限問(wèn)題存在，倒是一般儀器有個(gè)40Mpa的上限。如果色譜分離度還能滿(mǎn)足分析方法要求，柱壓只要儀器能承受就OK吧。  

13.不知道流動(dòng)相已走完，液相色譜柱空走了大概一晚上，請問(wèn)這種情況下柱子還能用嗎？如果可以應該如何再生？  

答：能用的！可能柱子里會(huì )有氣泡進(jìn)去，但只要多用流動(dòng)相沖沖，看到基線(xiàn)穩定，就沒(méi)問(wèn)題了。用色譜柱的保存液低流速長(cháng)時(shí)間沖洗，然后，再檢測一下柱效，看柱子是否恢復，液相***好設置一下***低壓限，這樣就不怕流動(dòng)相***而會(huì )損傷色譜柱。  

14.在梯度洗脫的時(shí)候，如果整個(gè)時(shí)間程序越長(cháng)，保留時(shí)間的重現性越差，尤其是后出的峰重現性差更明顯，怎么盡量避免這種情況的出現，使保留時(shí)間重現性更好？  

答：這個(gè)要控制好環(huán)境溫度和柱溫，易揮發(fā)的流動(dòng)相要適當密封，同時(shí)，保留時(shí)間的漂移與儀器的精度也有關(guān)系。  

15.一般正常使用一個(gè)C18柱能用多長(cháng)時(shí)間？  

答：柱壽命一般不按時(shí)間計算，按持續進(jìn)樣針數比較科學(xué)。一般正常使用維護，不超過(guò)pH和溫度等范圍，C18柱能達到500～2000針進(jìn)樣的壽命，視樣品干凈程度的不同而不同。  

16.請問(wèn)怎么測柱效？（柱子填料是SinoChromODS-BP5μm，規格4.6mm×200mm）  

答：測定柱效不同公司不一樣，有用甲苯，也有用萘的。一般柱子里面有檢測報告，你按照報告里的方法做一遍就可以。  

17.峰形后拖尾是什么原因造成的？  

答：[柱物理?yè)p壞]色譜柱有物理?yè)p壞是造成峰形拖尾的根源。***的解決方法就是更換新柱。  

[柱內填料污染]流動(dòng)相和樣品中的雜質(zhì)是色譜柱主要污染源。流動(dòng)相所用的各種溶劑至少是分析純，盡量使用色譜純試劑。流動(dòng)相所用的水***好是超純水或全玻璃器皿雙蒸水。用前先用0.45μm溶劑微孔過(guò)濾（器）過(guò)濾，除去可能存在的微粒。流動(dòng)相建議現用現配，對于含鹽的溶液尤其注意長(cháng)置會(huì )產(chǎn)生細菌或出現沉淀。此外還得保證儲存流動(dòng)相的容器清潔。復雜樣品可選用0.45μm溶劑微孔過(guò)濾（器）或樣品預處理柱對樣品進(jìn)行預處理，確保樣品中不含微粒雜質(zhì)。若樣品不便處理，要使用保護柱。柱內填料污染時(shí)，可將柱頭螺絲卸下，用專(zhuān)用工具挖出柱內前段被污染填料，再以相同的填料重新填入，修復，或以能溶解污染物的流動(dòng)相按色譜柱使用的相反方向，沖洗色譜柱（約20至30倍柱體積，或視具體情況而定；另外，此時(shí)不能接檢測器），將污染物沖出色譜柱，再按色譜柱標明的使用方向使用。  

[柱進(jìn)口處有異物]  

 當斷定是柱進(jìn)口處有異物時(shí)，可將柱頭螺絲卸下，取出濾帽并將其置于20%硝酸溶液中，用超聲波清洗約20分鐘，再置于超純水中，并用超聲波清洗約10分鐘，重新裝入色譜柱內即可。  

[樣品濃度過(guò)高致使柱超載]  

樣品在柱上超載能引起峰展寬，拖尾（或伸舌）。  

適當減小進(jìn)樣量或樣品濃度（需要時(shí)，可提高檢測器靈敏度）直至峰形和保留時(shí)間不再改變，便可消除這種不良影響。減小進(jìn)樣量還能改善其分離度。正常情況下，樣品中每種化合物在150×4.6mm柱中進(jìn)樣量保持在3～50μg范圍內，不會(huì )引起明顯超載。  

[樣品溶劑不對]  

選擇合適的樣品溶劑，以排除不必要的干擾，***好選用流動(dòng)相溶解樣品。  

[柱外效應]  

柱外效應（即，進(jìn)樣閥、色譜柱及檢測器間的管路過(guò)長(cháng)、直徑過(guò)粗、管路接頭不匹配、有死體積）是影響色譜柱柱效的主要因素之一，所以，在可能的條件下，色譜柱的兩端連接管路要盡可能短，連接管內徑盡可能細小，切口務(wù)必平整光滑，盡可能的減小死體積，以防止因樣品擴散造成不能反映色譜柱真實(shí)柱效等情況發(fā)生。  

[緩沖不足或不合適]  

在緩沖不好或離子強度過(guò)低的分離中，也會(huì )出現保留時(shí)間重現性差和峰形拖尾。增加緩沖濃度（與樣品大小相匹配）能改善此情況。  

[硅醇基團作用]仔細分析色譜柱內填料表面性質(zhì)可知：反相色譜柱填料的表面大約被鍵合相覆蓋了一半，其余的就是未被鍵合的硅醇基團。所謂的保留是指樣品分子與鍵合相相互作用的結果。但是，酸性或堿性化合物與硅膠表面殘存的硅醇基團或金屬雜質(zhì)之間相互作用而引起雙重保留機理，因此，發(fā)生了峰形拖尾。  

為了減小峰形拖尾，通?？稍诹鲃?dòng)相加入25mM三乙胺（抑制劑）。三乙胺能與硅醇基團發(fā)生強烈的相互作用，從而降低或阻斷樣品分子與硅醇基團的作用，以保證保留機理正常進(jìn)行，并大大緩解了峰形拖尾。使用長(cháng)鏈的硅醇基抑制劑，雖起效較慢，但，持續力較三乙胺長(cháng)。因為抑制劑分子中除了胺基與硅醇基團發(fā)生極性作用外，大分子中非極性部分與固定相也會(huì )發(fā)生反相作用而產(chǎn)生保留現象。如果，將抑制劑加至樣品中，效果會(huì )顯著(zhù)。  

[柱內金屬污染]  

柱內金屬污染（Fe，Ni等）可引起某引些化合物峰形拖尾。金屬可由填料本身帶進(jìn)，也可由腐蝕性流動(dòng)相緩慢溶解柱進(jìn)口的金屬濾片，隨流動(dòng)相沉積到柱填料中，例如，C18柱填料被金屬污染后，造成酸性/堿性樣品拖尾，可用堿洗/酸洗后再鍵合的填料，得到的峰是尖銳且對稱(chēng)的。  

18.哪些原因會(huì )造成色譜峰變寬、峰高變低，有哪些解決辦法？  

答：確實(shí)是這樣，如果其它色譜條件沒(méi)有改變，柱效下降是導致峰變寬的主要原因。對于易電離的極性物質(zhì)，如果流動(dòng)相pH選擇不合適，分析物既有中性分子態(tài)存在，又有離子態(tài)存在，峰也會(huì )變寬變矮。  

色譜柱使用后柱效逐步下降是正?，F象，如突然降低則屬異常。柱效下降原因有很多，但柱效快速下降則多半是使用不當，造成填料特性或柱床結構改變所致。如超過(guò)使用pH范圍造成的固定相和硅膠基體的流失、柱床塌陷等；還有強保留物質(zhì)吸附在填料表面，形成非特異性吸附層，完全改變了原有固定相的表面活性和分離性能，使柱效下降；另外進(jìn)樣時(shí)的壓力脈沖，也會(huì )破壞柱床結構影響柱效。  

參考文獻來(lái)源于：制藥微生物檢測。  

質(zhì)量控制部

2019年08月02日